系級:生物農業科技學系3年級

學號：0982475  姓名：陳巧婷

本校實習課程名稱：Drug screen

校外實習單位名稱：中央研究院 細胞與個體生物學研究所 許惠真老師實驗室

實習時間：2011/06/27~2011/08/26

實習期間所獲知的經驗及感想

I、實習內容：

    針對懷孕或者是想生小孩的婦女，通常醫生都會建議她們，不要亂吃藥物，如:感冒藥、頭痛藥、治癌藥、治腫瘤藥等。然而必須接受癌症治療的女性癌友，通常就只能請他們放棄生小孩的念頭，因為這些藥物內的成分中，有部分可能會造成胎兒的畸形，或者是女性的不孕。

    然而，至目前為止，並沒有相關的數據或是論文研究可以證明相關的概念，所以我們想根據這個議題，作進一步的討論:探討當婦女服用這些化合物時，會對嬰兒的neural crest cell與女性的Germ-line stem cell造成什麼樣的反應？

    在王文德老師實驗室已經初篩約三千種的化合物，發現其中有23種化合物會對zebrafish embryonic neural crest cells (NSCs)造成明顯的影響：造成黑色素細胞減少或頭顱軟骨的不正常等。因此，根據這個結果，我繼續檢視了其中的11種化合物，觀察其對Drosophila Germ-line stem cell (GSC)的影響。

II、實習經驗:

一、基礎入門

    此階段雖然只有短短一周的學習時間，但或許是因為每天都在看、在練習，且為一對一的教學，所以比起在學校上實驗課時更容易上手、同時也學得比較細:

1、雌雄的辦認:可藉由腹側生殖器的有無或性梳的有無作辨認

2、Toss yw(wt的一種)

3、認識balancer

A、X chromosome(FM7C and bifi)

   ♀FM7C/bifi→紅眼心形

    FM7C/FM7C→白眼心形(不孕)

    bifi/bifi→紅眼桿狀

   ♂FM7C→白眼心形

    bifi→紅眼桿狀

B、second chromosome(cyo)

    蜷翅

C、third chromosome(TM6B and TM3)

    TM6B→Hu(多毛)

    TM3→Sb(短毛)

4、Virgin的收取

特徵:體色偏白，且約在腹側附近會有胎糞，通常在vial清空後的八小時內收取得都是。

5、Dissect

注意dissect的過程必須講求快且準，使ovary 能夠在不受到傷害得環境之下，仍能健康得繼續保持活動態。

6、Immunostaning

需要耗時較長的時間但每一個步驟都有期要注意的小技巧，必須注意。

Eg. Teased apart時要盡量完全，染抗體的時候才能染得好，但要小心不

   要傷到germarium.

7、製作fly food 以及molasses plate.

二、實驗(egg count)

其實這個實驗的操作並不困難，只是礙於我手邊化合物的藥量有限，所以必須想出一個最少藥的情況之下，可以讓果蠅乖乖得服下這些藥物:

Test1 (egg count by molasses plate*3)

    將compounds與wet yeast混合在一起，在每一個bottle內set up五對果蠅，每天toss以計算平均每隻果蠅每天的產蛋量。

    然而這個方法我在測試了13天之後發現是不可行的，一來是因為控制組一直處在一個不穩定的狀態、二來則是因為我們推測compounds可能會被活酵母代謝掉而改變原本設定的濃度甚或失去藥效。

Test2 (egg count by molasses plate*3)

    將compounds與fly food混合在一起，在每一個bottle內set up五對果蠅，每天toss以計算平均每隻果蠅每天的產蛋量。

    這個方式我在測試三天之後即立即停止了，因為我們發現少量的fly food 在molasses plate 很快就會過乾，導致果蠅不喜歡吃，產蛋率自然就下降了，故會干擾我們的實驗。

Test3 (egg count by vial*5)

    將fly food 的表面畫許多細線之後，加入水並使其自然風乾，在每一個vial 內set up 一對果蠅，每天toss以計算平均每隻果蠅每天的產蛋量(藉由計算pupa的數量)。

    在測試了五天的控制組後確定此法是可行的，只是另外要注意稀釋好的compounds必須事先分裝成小單位存放在－20℃，以確保compounds維持穩定，並且每天必須加水以保持fly food 的濕度，好讓larvae 順利爬出形成pupa。

Exp1 (egg count by vial*5)

將fly food 的表面畫許多細線之後，加入水並使其自然風乾，在每一個vial 內set up 一對果蠅，每天toss以計算平均每隻果蠅每天的產蛋量(同時計算egg and pupa的數量)。

在經過14天的實驗之後，經由每個compounds所導致的產蛋率結果，我們挑出四種與控制組相比似乎有點受影響的compounds，並將吃了此compounds14天的果蠅進行dissect，觀察是否對ovary造成影響，且結果是肯定的，至於原因為何則有待進一步實驗的進行。

在這次的實驗讓我們確定：利用egg的數量計算產卵率。而且為了維持fly food 的濕度一致，我將初步製作好的fly food進行分裝，以維持其能受到相同次數得微波，以降低濕度差異造成果蠅對fly food的喜好程度。此外在製作fly food時必須注意其品質，避免表面得凹凸不平以及孔洞得發生，以免加compounds時無法完全覆蓋fly food的情形。

Exp2 (egg count by vial*9)

將fly food 的表面畫許多細線之後，加入compounds並使其自然風乾，在每一個vial 內set up 一對果蠅，每天toss以計算平均每隻果蠅每天的產蛋量(計算egg的數量)。

雖然在這次的實驗中我將compounds的濃度提高到原本的兩倍，但卻沒有看到相對於控制組漸漸減少的曲線，因為時間的關係所以也來不急進行dissect，看ovary、進行immunostaning以確認到底是否有哪個環節出問題。

但就我個人的猜測，可能是我們觀察的時間還不夠久，又或者是我當初在set up 果蠅時果蠅本身的品質就不健康，導致數據一致性的奇怪也死了很多的果蠅。在這樣的情況下，這個的實驗數據比較無法令人採信。

III、實習心得:

    雖然在學校也曾經用果蠅作過實驗，對果蠅有一點點基本的認識，但是在到許惠真老師的實驗室經過兩個月的實習之後，我才發現自己之前所學得不過是最基礎的皮毛罷了：光是一個balancer的運用就隱藏了滿滿的知識，有了它才能讓我們cross 出適合自己實驗的品系，並從這些茫茫大海中將他們挑出來。

    Bioassay、drug screen這些字眼，曾經對我來說只是在書本上看過、聽老師說過的事，雖然知道對在做生物實驗的人來說是一件很重要的概念，但對我而言始終還是覺得很遙遠、不切實際。但是經過這兩個月的洗禮，我慢慢的明白這是一件有趣、重要，卻又常常因為一個細節的不注意而變得不受控制的事。畢竟對動物而言彼此與彼此間一定有其個體差異，所以要如何挑選出健康且品質一致的果蠅作實驗這又是一層經驗累積的學問了。

    這個暑假對我來說應該是我目前所經歷過的所有暑假中最充實得暑假，雖然少了出去玩得機會，但是在實驗室中讓果蠅陪我度過假期也是一件很不錯得體驗，更重要的事這次的實習讓我認識到好多好強好厲害的人，讓我更加激勵自己：人外有人、天外有天，如果我在不努力積極加強自己得能力，很快我一定會在這個社會失去競爭得能力而被淘汰。

    另外，經過這次的實習經驗，我要逼自己改進兩件事情：第一件就是英文聽、說、寫的能力，因為聽不懂英文讓我跟很多知識擦肩而過，英文口說能力不佳讓我在上台報告時無法完整得傳達我要的意思給台下的聽眾，至於英文寫做得能力不佳、單字庫不足讓我在PPT上用錯字，鬧了笑話還不自知；第二件則是我要讓自己加速：很多實驗必須花上很長的時間，有時可能同時進行多個實驗，慢吞吞只會拖慢自己的實驗進度與休息時間，而且最重要的一點事，在果蠅的實驗中有很多地方都講求快，因為只要一慢果蠅在二氧化碳下待太久就可能被我用得不健康、甚至死亡，又或者是想看的組織在自己的慢慢來中變了樣。

    謝謝這個實驗的每位學長姐，因為你們的熱心與耐心，願意花時間教我這個粗線條、又手腳慢吞吞的人，因為有你們讓我學到了好多：不論在果蠅的相關知識或製作報告的技巧，在summer student meeting中也給了我很多的指教與建議，我都會虛心接受並銘記在心，畢竟在這裡經歷了人生第一次用英文報告給台下這麼多人聽，我永遠都不可能會忘。